Sustitúyese el artículo 23 del decreto 141/967, de 23 de
febrero de 1967, el que quedará redactado de la siguiente forma:
"ARTICULO 23. (Del contralor de eficacia) - Se aplicarán los
métodos indicados en el artículo 21.
BASES Y NORMAS
La actividad de una vacuna antiaftosa es expresada en función
del porcentaje de bovinos que esa vacuna es capaz de proteger contra
la aparición de lesiones podales secundarias, después de la prueba
virulenta más severa.
La prueba virulenta más severa consiste en inocular por vía
intradermolingual la cantidad de virus de prueba necesaria para
provocar en todos los casos, en bovinos perfectamente sensibles, la
aparición de lesiones secundarias en las patas.
Los virus a emplear en las pruebas de eficacia seleccionados por
la Dirección de Lucha contra la Fiebre Aftosa, en base a estudios de
las cepas actuantes en el campo y su relación con las cepas empleadas
en producción de vacunas.
Los virus de prueba, serán proporcionados por la Dirección de
Lucha contra la Fiebre Aftosa a los laboratorios comerciales que lo
soliciten.
A) Método del índice de protección "K" sobre bovinos
Principio.- El índice de protección "K" es definido por la
relación K=T/V en la cual T es el título de virus aftoso calculado
sobre bovinos testigos y V el del mismo virus calculado sobre bovinos
vacunados. Representa un número de unidades infecciosas cuya
inoculación en la mucosa lingual de bovinos vacunados provoca la
aparición de lesiones primarias en el 50% de los animales.
El índice K varía de acuerdo con la magnitud de la inmunidad
Postvacunal juzgada por la tasa de protección contra las lesiones
podales secundarias.
Se deduce que la determinación de "K" para una vacuna dada
permite conocer la tasa probable de protección que esta vacuna puede
conferir al bovino.
Material.- I) Bovinos: se usan lotes de bovinos con 18 o más
meses de edad perfectamente sensibles al virus de la fiebre aftosa,
que no hayan enfermado o estado expuestos a dicho virus, ni hayan
sido vacunados contra la enfermedad y cuya tasa de anticuerpos, para
los virus O, A y C, detectada por pruebas de neutralización o
protección corroboren lo anteriormente mencionado.
II) Virus: las cepas de virus de prueba de tipo O, A y C, son
producidas "in vivo" por inoculación intradermolingual en bovinos.
Sus títulos deben ser por lo menos, iguales a %g para
el bovino.
Método: Se utilizan cuatro animales como mínimo, vacunados y
cuatro testigos para cada tipo de virus contenido en la vacuna.
I) Vacunaciones - Son hechas de la misma manera recomendada por el
laboratorio productor o importador.
II) Titulaciones - Son efectuadas al término del plazo que el
laboratorio interesado considere necesario para el establecimiento de
la inmunidad y hechas sobre los animales vacunados y testigos en el
mismo momento y con las mismas suspensiones virulentas. Para el
cálculo se utilizan los procedimientos de Reed y Muench, Sperman-
Karber, etc.
En las condiciones corrientes de control, las suspensiones
virulentas pueden ser de (10 elevado a la menos 4) a (10 elevado a
la menos 7) para los testigos de (10 elevado a la menos 3) a (10
elevado a la menos 6) para los vacunados.
Las lecturas de los resultados son efectuadas a las 24 horas en los
animales testigos y a los 40 horas en los vacunados.
Resultado: Para determinar "K" basta obtener el cociente de T/V,
Ej.
Sea T = 10 elevado a la 7 punto 5, y
V = 10 elevado a la 5 punto 2,
T 10 elevado a la 7 punto 5
Se tendrá K = --- = ------------------------- = 10 elevado a la 2 punto 3
V 10 elevado a la 5 punto 2
Interpretación: La clasificación de las vacunas será hecha con arreglo al
menor índice de protección K de los componentes que la integran.
Si ese índice es:
a) Inferior a 10 elevado a la 1 punto 8 la vacuna es rechazada; y
b) Igual o superior a 10 elevado a la 1 punto 8 la vacuna es autorizada.
B) Método del índice de protección "C" en cobayos
Principio: El índice de protección "C" es definido por la relación
T
C = --- en la cual T es el título del virus aftoso calculado
V
en cobayos testigos y V el del mismo virus calculado en cobayos vacunados.
Representa un número de unidades infecciosas cuya inoculación en el
cojinete plantar de cobayo vacunado provoca la aparición de lesiones
podales de generalización en 50% de ellos.
El índice "C" varía, dentro de ciertos límites, con la magnitud de la
inmunidad conferida al bovino por las mismas vacunas.
Se deduce que la determinación de "C" para una vacuna dada, permite,
dentro de estos límites, conocer la tasa probable de protección que esa
vacuna puede conferir al bovino.
Material: I) Cobayos: Cobayos de patas depigmentadas, de 550 gr. de peso
(tolerancia +- 50 gr.);
II) Virus: Las cepas de virus de pruebas de los tipos O, A y C deben estar
adaptadas a cobayo.
Se considera que una cepa está adaptada cuando, después de la inoculación
en el cojinete plantar, de 0.05 ml. de una suspensión virulenta de 10
elevado a la menos 2 al porcentaje de cobayos que desarrollan una lesión
secundaria podal es de 90% como mínimo.
Esta adaptación debe ser obtenida después de un número limitado de
pasajes, 5 a 7 como máximo.
Método: para cada valencia vacunal se utilizan 28 cobayos vacunados y 28
testigos, como mínimo.
I) Vacunaciones. Son hechas por vía subcutánea. La dosis vacunal es igual
a un vigésimo de la dosis recomendada para el bovino por el laboratorio
elaborador o importador.
II) Titulaciones. Tienen lugar 3 (tres) semanas después de la vacunación
dependiendo del tipo de vacuna y son hechas sobre los testigos y los
vacunados al mismo tiempo y con las mismas suspensiones virulentas. En las
condiciones corrientes de control, las suspensiones virulentas pueden ir
de 10 elevado a la menos 3 a 10 elevado a la menos 6 para testigos y de 10
elevado a la menos 2 a 10 elevado a la menos 5 para los vacunados.
a) Titulación en Cobayos Testigos. El título es expresado por la DG 50%
(dosis generalizante 50%) es decir, por la cantidad de virus
necesaria para provocar generalización podal al 50% de los cobayos.
Los 28 cobayos son divididos en 4 grupos de 7 y reciben
respectivamente, por inoculación intradérmica en uno de los
cojinetes plantares, 0,05 ml. de cada una de las suspensiones
virulentas antes indicadas. La lectura de los resultados es hecha a
las 72 horas. Un cobayo es considerado como habiendo generalizado
desde que presenta una lesión podal secundaria. El cálculo de la DG
50% se hace de acuerdo con los procedimientos conocidos (Reed y
Müench; Spearman-Karber, etc.;
b) Titulación en Cobayos Vacunados. El procedimiento es igual al usado
con los testigos.
Resultados: Sólo son válidos si los títulos de virulencia en los
testigos son por lo menos iguales a 10 elevado a la 6 DG 50% gr.
Para determinar "C" basta obtener el cociente de T/V
Ejemplo:
Sea T = 10 elevado a la 5 punto 8, y
V = 10 elevado a la 3 punto 2,
T 10 elevado a la 5 punto 8
Se tendrá C = --- = ------------------------- = 10 elevado a
V 10 elevado a la 3 punto 2 la 2 punto 6
Interpretación: Cuando el índice "C" para un tipo de virus dado es
igual o superior a 10 elevado a la 2 punto cinco la vacuna es
aceptada para la valencia correspondiente.
Por debajo de aquel valor no es posible extraer ninguna conclusión
y se deberá recurrir al método del índice "K" en bovinos.
C) Método del índice de seroneutralización "S" en cultivos celulares.
Principio: El índice de seroneutralización "S" en cultivo de tejidos es la
tasa media de anticuerpos séricos neutralizantes de un grupo de bovinos
vacunados. Se expresa por la media de las tasas de dilución de los sueros
de bovinos vacunados que protegen cada uno al 50% de los tubos de cultivo
contra la acción citopática de una suspensión virulenta.
El índice "S" varía, dentro de ciertos límites, de acuerdo con la
magnitud de la inmunidad post-vacunal. La determinación de "S" para una
vacuna dada, permite pues, dentro de esos límites, conocer la tasa
probable de protección que dicha vacuna puede conferir al bovino.
Material: I) Bovinos. Se necesitan por lo menos cuatro bovinos que reúnan
las condiciones especificadas en el capítulo del Indice "K", vacunados en
la forma indicada por el laboratorio productor o importador.
II) Sueros. Los sueros de cada bovino son extraídos tres semanas después
de la vacunación dependiendo del tipo de vacuna.
III) Cultivos celulares. Son cultivos de células efectuados en monocapas.
Para su empleo, el medio nutritivo es reemplazado por un medio nuevo,
denominado de "mantenimiento".
IV) Virus. Las cepas de virus de prueba de los tipos O, A y C deben estar
adaptadas al cultivo en estractos celulares. Sus títulos deben ser por lo
menos iguales a 10 elevado a la 7 DICT 50% por ml. (10 elevado a la 7
dosis infecciosas para cultivos celulares 80%).
Método. Es denominado el método de virus fijo y suero variable.
V) Suspensiones Virulentas. Se utiliza el medio de mantenimiento usado en
los cultivos celulares, de manera que la suspensión de trabajo contenga
1000 DICT 50% por ml.
VI) Diluciones de los sueros. Cada suero, después de inactivado por
calentamiento a 56ºC., durante 30 minutos, es diluido en el mismo medio
que usado para preparar las suspensiones virulentas. Las diluciones son
hechas según una progresión geométrica de razón 2.
VII) Reacción Virus-suero. Se agrega a un mililitro de cada dilución de
suero, 1 mililitro de suspensión virulenta, se agita y luego las mezclas
son colocadas en estufa a 37ºC. durante una hora, haciéndose una segunda
agitación a los 30 minutos.
VIII) Reacción final:
a) Preparación (cultivos celulares + mezclas sueros-virus)
Cada una de las mezclas suero-virus, es distribuida en tubos de
cultivos celulares a razón de 0,2 ml. de mezcla por tubo. Cada tubo
recibe pues, 100 DICT 50%.
Se emplearán en todas las pruebas de índice "S" los siguientes
controles:
- Testigos cultivos celulares
- Testigos sueros
- Testigos virus.
b) Incubación. Todas las series de tubos son puestas en estufa a 37ºC.
durante 72 horas.
Resultados:
I) Lectura. Se anota, en cada serie de tubos, aquéllos cuyo tapiz
está destruido, los resultados sólo son calculables e interpretables,
cuando:
a) No hay ninguna destrucción de los tubos testigos - cultivo y
testigos - suero;
b) La destrucción completa en todos los tubos testigo - virus; y
c) El título de la suspensión virulenta utilizada muestra que en
las reacciones se utilizaron, efectivamente 100 DITC 50%.
II) Cálculos. Para cada suero se calcula, con ayuda de series de
tubos que contienen la mezcla suero-virus y usando los métodos ya
mencionados, la dilución del mismo, que corresponda a la destrucción
del tapiz celular del 50% de los tubos.
Como dicha tasa es expresada en log. de 2, es más cómodo expresarla
en log. de 10, lo que se hace tomando como exponente del 10 el
producto del exponentes de 2 x 0,3.2 elevado a la menos 5 punto 6.
Ejemplo: Si la tasa es de 2 elevado a la menos 5 punto 6 se
escribirán
10 elevado a la menos 5 punto 6 x 0,3 = 10 elevado a la menos 1.68
y por conversión: 10 elevado a la 1.68
Como el índice de seroneutralización "S" representa la tasa media de
los sueros estudiados, para calcularlo se hace la media de los log.
de las tasas individuales encontradas.
Ejemplo: Para 4 sueros se encuentran las respectivas (tasas) de
10 elevado a 1.2, 10 elevado a 1.5, 10 elevado a 1.8 el índice "S" es:
10 elevado a (1.2 + 1.5 + 1.5 + 1.8)
------------------------------------ = 10 elevado a 1 punto 5
4
Interpretación: Cuando el índice de seroneutralización "S" con respecto a
cualquiera de los tipos de virus, es igual o superior a 10 elevado a 1
punto 5 la vacuna es aprobada para la valencia correspondiente.
Por debajo del valor 1.5 no es posible extraer ninguna conclusión y se
debe recurrir al método del Indice "K" en bovinos.
D) Método del índice de seroprotección en ratones lactantes I.S.P.
Principio: El I.S.P. está definido por la relación
T
ISP = --- en el cual T es el título del virus de comprobación en los
S
ratones testigos y S el de los ratones inyectados con suero.
El I.S.P. representa las DI sub 50 RL neutralizados por 0,1 ml. de suero
inyectado por vía subcutánea en ratones lactantes de 5 a 7 días de edad.
Material: Bovinos y sueros: Los mismos indicados por el índice S.
Ratones: Se utilizan ratones lactantes blancos de 5 - 7 días de edad.
Virus: Las cepas de control son de epitelio bovino; también pueden
utilizarse cepas adaptadas a cultivos celulares utilizando el pasaje más
bajo posible. Dichos virus deben conservarse a temperatura de - 70ºC. o
inferiores, en forma de suspensiones monovalentes virulentas fraccionadas.
Estas suspensiones deben tener como mínimo las dosis letales 50% (DL 50%
ratón lactante) necesarias para realizar correctamente la prueba.
Método:
Inyección del suero. Cada suero sin diluir y previamente inactivado a
56ºC. durante 30 minutos es inyectado por vía subcutánea en 24 ratones
lactantes - como mínimo - a la dosis de 0,1 m. por ratón.
Diluciones de virus. Los ratones con suero son inoculados con las
diluciones que pueden ser de 10 elevado a 3 a 10 elevado a 6 DLRL 50%/ml.
y los testigos con las diluciones que pueden ser de 10 elevado a la menos
cuatro a 10 elevado a la menos siete DLRL 50%/ml. dependiendo del título
del virus utilizado.
Inoculación de virus:
Transcurrida una hora, los ratones inyectados con suero son divididos en
4 grupos. Cada grupo es inoculado por vía intraperitoneal con una dilución
de virus, a la dosis de 0.05 m. por ratón, de manera de determinar el
título del virus S.
A la vez, la misma suspensión virulenta es titulada en ratones que no
hayan sido inyectados con suero, a los fines de determinar el título del
virus T.
El procedimiento de titulación del virus es el siguiente:
Material y Método: Las diluciones de virus previamente seleccionadas,
preparadas en medio Earle, Eagle, Frenkel, etc., son inoculadas por vía
intraperitoneal en ratones lactantes de 5 a 7 días de edad, a la dosis de
0.005 ml. por ratón. Con cada dilución de virus se utiliza como mínimo, 6
ratones. La prueba se lee diariamente durante siete días. La infecciosidad
se expresa en dosis letales 50% en ratón lactante por ml. (DLRL 50%/ml.) y
se calcula a partir de los resultados del séptimo día de lectura por los
procedimientos de Reed-Müench y Sperman-Karber. El título final de cada
suspensión es la media de por lo menos dos titulaciones.
Controles: En cada prueba se incluye un suero bovino sin anticuerpos y
otro con un ISP entre 1.5 a 3.5.
Resultados: El índice de seroprotección de una valencia de una vacuna es
la diferencia entre el log. 10 DL 50 de los ratones testigos (T) y el log.
10 DL 50 de los ratones inyectados con suero (S), es decir:
ISP = Log. DL 50 RL (T) - Log. DL 50 RL (S).
Interpretación:
Los datos de una prueba son sólo válidos cuando han presentado un
desarrollo normal.
Una serie de vacuna es aprobada cuando todas sus valencias proporcionan
un ISP igual o mayor a 2,5 en seis o más de los 8 bovinos vacunados".